Studium interakce proteinů rodiny p53 s DNA modifikovanou novými typy fluorescenčních značek
Většina fluorescenčních technik používaných pro sledování DNA-protein interakcí využívá především terminálního značení používaných DNA prób. V této práci jsme se zaměřili na využití a aplikace cíleného fluorescenčního značení uvnitř DNA vazebných sekvencí. Enzymatická inkorporace modifikovaných 2′-d...
Uloženo v:
| Hlavní autor: | |
|---|---|
| Další autoři: | |
| Typ dokumentu: | VŠ práce nebo rukopis |
| Jazyk: | Čeština |
| Vydáno: |
2014
|
| Témata: | |
| On-line přístup: | http://is.muni.cz/th/393287/prif_b/ |
| Shrnutí: | Většina fluorescenčních technik používaných pro sledování DNA-protein interakcí využívá především terminálního značení používaných DNA prób. V této práci jsme se zaměřili na využití a aplikace cíleného fluorescenčního značení uvnitř DNA vazebných sekvencí. Enzymatická inkorporace modifikovaných 2′-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTPs) přestavuje jednoduchý způsob přípravy specificky značených DNA. Solvatochromní derivát 4-aminoftalimidu (API), jehož fluorescenční vlastnosti jsou ovlivněny polaritou vnějšího prostředí, byl přes linker konjugován na dCTP a byl použit pro přípravu DNA substrátů s API modifikovanými p53 vazebnými místy. Pomocí EMSA bylo zjištěno, že cílené API modifikace v rámci p53-specifické vazebné sekvence nezabrání vazbě proteinu p53 vázat se na tuto sekvenci. K vazbě proteinu p53 dochází i na stejným způsobem modifikovanou nespecifickou sekvenci. Pomocí měření fluorescence bylo zjištěno, že interakce samotných značených DNA substrátů s p53 byla spojena s postupným ná For most fluorescent techniques used in studies of protein DNA interactions, terminal labelling of probes is used. Here we focus on the use and application of targeted fluorescent labelling within the DNA binding sequences. Enzymatic incorporation of modified 2′ deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) provides a simple method for preparing specifically labelled DNA. Solvatochromic derivate of 4-aminophthalimide (API), whose fluorescence properties are affected by the polarity of the external environment, was via linker conjugated to dCTP and used for the preparation of DNA substrates with API modified p53 binding sites. Using EMSA it was revealed, that targeted API modification of p53-specific binding sequence did not abrogate the p53 protein binding to this sequence. Modified p53-nonspecific DNA substrates were bound by the protein as well. Fluorescence measurements revealed that interaction of labelled PEX products with p53 protein was associated with the gradual increase of the fl |
|---|---|
| Popis jednotky: | Vedoucí práce: Miroslav Fojta |
| Fyzický popis: | 40 l. : il. |