Studium interakce proteinů rodiny p53 s DNA modifikovanou reaktivními skupinami pro kovalentní biokonjugace - Čechová, Eva (2014)
V této práci jsme se zabývali přípravou specificky modifikovaných DNA pro následné biokonjugace s DNA-vazebnými proteiny rodiny p53. Pomocí enzymatické inkorporace (PEX) s využitím 2´-deoxycytidin trifosfátu s konjugovaným propargylvinylsulfonamidem (PVS) byly připraveny značené DNA substráty, které obsahovaly cíleně PVS-modifikovanou p53-vazebnou sekvenci. Radioaktivně značené DNA substráty byly inkubovány s proteiny p53, p63 a p73 (exprimované jako GST-fúzní konstrukty s centrální vazebnou doménou) a poté analyzovány pomocí nekompetiční EMSA. Bylo prokázáno, že za těchto podmínek se testované proteiny vážou jak na specifickou, tak nespecifickou PVS-modifikovanou sekvenci. Vlastní konjugační reakce byla provedena inkubací reakční směsi při laboratorní teplotě. Po následné mírné denaturaci byla reakční směs analyzována pomocí radioaktivní denaturační PAGE (detekce 32P-značené DNA), a pomocí imunodetekce s využitím specifických protilátek (detekce proteinů). Vznik kovalentních konjugátů