Příprava a funkční charakterizace rekombinantního lektinu RS20L
V centru pozornosti této diplomové práce se nachází protein RS20L produkovaný gramnegativní rostlinnou bakterií Ralstonia solanacearum. Přes veškeré snahy o funkční charakterizaci lektinu RS20L nebyly zatím tyto studie dokončeny. Ukázalo se, že po purifikaci protein ztratil své vazebné schopnosti. Z...
Uloženo v:
| Hlavní autor: | |
|---|---|
| Další autoři: | |
| Typ dokumentu: | VŠ práce nebo rukopis |
| Jazyk: | Čeština |
| Vydáno: |
2011
|
| Témata: | |
| On-line přístup: | http://is.muni.cz/th/211282/prif_m/ |
| Shrnutí: | V centru pozornosti této diplomové práce se nachází protein RS20L produkovaný gramnegativní rostlinnou bakterií Ralstonia solanacearum. Přes veškeré snahy o funkční charakterizaci lektinu RS20L nebyly zatím tyto studie dokončeny. Ukázalo se, že po purifikaci protein ztratil své vazebné schopnosti. Za jednu z množných příčin lze považovat silnou vazbu mannosy, která obsadila vazebné místo lektinu při purifikaci na mannan-agarosové koloně a následné eluci mannosou. Poté ji nebylo možné odstranit ani dialýzou. Možným řešením se jevilo připojení oligohistidinové kotvy a následná purifikace za pomoci metalochelatační chromatografie, čímž by se zamezilo navázání sacharidu do vazebného místa během purifikace. Praktické řešení tohoto problému in vitro bylo započato úspěšným vložením syntetického genu rs20l do vektoru pET-32c, který obsahoval sekvenci kódující His-tag na N-terminálním konci. Tím byl vyřešen problém s připojením oligohistidinové kotvy a byla umožněna purifikace lektinu RS20L jin This diploma thesis is focused on protein RS20L produced by Gram-negative bacteria Ralstonia solanacearum. Function studies of this lectin has not been finished yet, because protein lost its binding abilities after purification on mannan-agarose column. One of the possible reasons could be very strong binding of mannose to the binding site of lectin during purification where mannose was used for protein elution. It couldn´t be removed even by dialysis. The attachment of His-tag to the protein followed by purification on Ni-NTA column without using mannose could be solution to this problem. Practical solution to this problem was started by successful insertion of the rs20l gene into the vector pET-32c, which resulted in a protein containing a sequence encoding His-tag on N-terminal end. This allowed for purification of RS20L using immobilised metal-ion affinity chromatography on Ni-NTA agarose without presence of mannose during purification. However, the obtained protein was not pure e |
|---|---|
| Popis jednotky: | Vedoucí práce: Michaela Wimmerová |
| Fyzický popis: | 62 l. : il. |